作者： 时间：2024-04-12
Prior Scientific是一家英国的，专门从事精密定位设备，光学系统，自动化解决方案和显微镜组件的设计和生产的厂家。Prior Scientific推出了一款基于激光的自动对焦模块PureFocus850。PF850显微镜自动对焦模块具有强大的功能，它可以在样品成像过程中自动恢复和保持对焦，增强了现有显微镜的系统功能。PF850可以很方便的集成到现有的，主流商用显微镜当中，在生命科学领域和工业领域都有着广泛的应用前景。
在本文中，我们主要说明了PureFocus850与各种成像原理的显微镜的兼容性，并论述了为显微镜安装硬件自动对焦装置的优势。
PF850显微镜自动对焦模块在显微镜的优势
硬件自动对焦系统在生物显微镜技术中的作用极其广泛且重要，可用于提高成像通量，或者在长时间延时拍摄实验期间确保样品始终处于成像焦点。该系统能够利用样品反射的激光信号来确定其在空间中的位置，然后自动调节显微镜的聚焦（Z）轴，使样品重新回到成像焦点。
Prior的PureFocus850是一款用途极其广泛的硬件自动对焦设备，功能众多，能够适应多种的显微镜技术和样品类型。对于生物显微镜技术来说至关重要的是，PureFocus850可以追踪盖玻片表面，同时保持聚焦于其下方的样品。
相较基于相机型的自动对焦解决方案，该系统具有以下三大关键优势。
（1）PureFocus850不依赖样品内的对比度，这意味着荧光或未染色的样品可以更容易地保持聚焦。
（2）PF850的焦点捕获速度极快且实时对焦，而基于相机的解决方案则需要通过显微镜Z轴进行数秒的扫描。
（3）PF850作为硬件自动对焦解决方案可以追踪样品表面，因此不需要预先定义样品中不同点处的焦点图谱。
明场显微镜
薄切片的透射（透视）明场显微镜可以说是最常规的显微镜技术。简而言之，白光穿过样品，由不同结构特征在光吸收和散射上的差异构成图像。“明场”指的是与样品本身较暗的特征形成对比的近白色背景。
PureFocus850显微镜自动对焦模块具有补偿机制，可以通过追踪盖玻片的可控表面来保持对样品的聚焦，即使是对于最标准的载玻片成像来说，这也是必不可少的功能。生命科学样品的反射性较弱，因此PureFocus850可以转而探测盖玻片。补偿机制能够实现当Purefocus850聚焦在盖玻片上时，显微镜目镜或相机恰好聚焦在样品上。
然而，某些应用（例如血细胞分析）需要高放大倍数油浸物镜才能足够详细地解析样品特征。在这种情况下，PureFocus850无法探测盖玻片的外表面，因为浸镜油和玻璃的折射率非常接近。但是可以通过调节补偿，改为探测盖玻片的内表面。明场显微镜通常会使用在可见光谱中具有高检测效率的彩色相机：PureFocus850激光器可使用红外波长，以避免激光信号出现在样品图像上。
暗场显微镜
透射暗场显微镜在生命科学领域中的应用相当广泛。最常见的是用于观察固有对比度较低的组织切片或细胞，该特性使这类样品不适合使用明场显微镜来观察。
暗场显微镜依靠的是在穿过样品时被反射或折射的光，这样的光线会被物镜收集。任何未受样品影响的光线都不会被收集。这会导致背景变暗（因此得名暗场！），而样品则明亮地呈现。这样反而能够在不对样品进行染色的情况下观察到细胞内的细节，或者更容易检测到样品中的小颗粒或污染物。
由于PureFocus850不依赖对比度来获得焦点，所以暗场显微镜所产生的普遍稀疏的信号并不会影响其性能。暗场还容易使样本平面之外的物体在图像中发亮，而基于相机的自动对焦技术可能会错误地聚焦在这些物体上。由于PureFocus850仅依靠盖玻片来进行对焦，所以能够最大程度避免发生此类错误。
荧光显微镜
虽然暗场显微镜可以在透明样品中提供对比度，但它们不会突显特定的特征结构，并且会受限于突显特征的大小。相比之下，荧光显微镜则可以通过对活细胞或生物体的转化或对切片的标记，来定位和识别特定的细胞器和其他亚细胞结构。
荧光是指物体（在显微镜领域中通常是结合在蛋白质上的分子标记）吸收某一波长的光并随后发射出更长波长的光的现象。只需在显微镜上配备只允许后者波长的光到达检测器的元件，就能够利用这种吸收信号和发出信号的差异来实现仅检测荧光分子标记所发射的光信号。其最终结果就是在黑暗的背景中强烈地突显出这些特定的结构特征。
具有不同荧光标记的多个特征结构可以在同一样本中进行成像。滤光片转轮和转台等机动设备可以将正确的激发滤光片（用于选择吸收波长）和发射滤光片（用于选择发射波长）移动到显微镜光路中，并按顺序成像，随后即可生成包含不同标记的合成图像。
荧光显微镜的应用范围很广，涵盖了从相对简单的宽场技术，如荧光原位杂交（FISH）或高通量筛选，到更为复杂的高端显微镜方法，如转盘共焦显微镜和全内反射显微镜（TIRF）等。
通常来说，荧光标记所需的激发光波长均在近紫外到远红外之间。因此，任何硬件自动对焦系统都不能干扰用于生成图像的任何波长。PureFocus850显微镜自动对焦模块使用850nm激光，该激光超出了Cy7的发射波长，Cy7是一种常见的荧光标记，发射光接近近红外光谱。此外，PureFocus850可以透过近紫外光和可见光，因此能够安装在荧光光学组件和物镜之间。这一点非常重要，因为它能够在配置荧光显微镜时为光学组件的选择提供完全的灵活性。
偏光显微镜：
偏光显微镜下，样品将显示其双折射性——线偏振光在穿透样品时将发生“双重折射”，产生两束彼此呈90°偏振的光线。在穿过检偏器时，这些光线组分会相互干涉，进而增强样品特定区域的对比度，并使其因特性的不同而呈现不同的颜色。天狼星红是一种病理学染色剂，可用于检测纤维变性，并且会使胶原蛋白在偏振光下呈现红色。对于未染色样品的成像，偏振也大有用处，例如辨别痛风晶体或者分析岩石样品。
需要将PF850应用在偏光显微镜上，只需要调整自动对焦系统的安装。PureFocus850是安装在显微镜的无限远空间内的，因此可以兼容偏光显微镜。应该将其安装在偏光显微镜的物镜和检偏器之间以避开干扰。大多数商用显微镜都可以将检偏器安装在PureFocus850显微镜自动对焦模块和显微镜相机或目镜之间。
微分干涉相差（DIC）显微镜：
PureFocus850显微镜自动对焦模块可以在扫描大面积区域或多孔板时确保对特定焦平面的高度专注，因此显微镜专家们能够充分地利用DIC的高轴向分辨率。与偏振光显微镜的安装方式相同，PureFocus850必须放置在物镜和检偏器之间，而所需的其他组件（尤其是Nomarski-Wollaston棱镜）则不会影响其性能。尽管PureFocus850激光会两次穿过棱镜（前往样品和从样品返回），但激光的分割和重新合并不会显著影响PureFocus850传感器上的信号强度。
PF850显微镜自动对焦模块具有强大的功能，可以增强现有生物显微镜的系统功能，在生命科学领域有着广泛的应用前景。
