作者： 时间：2024-06-25
荧光显微镜作为光显微镜的一个分支，利用荧光效应来观察纳米尺度的结构和过程。该技术依赖于荧光染料，这些染料在受到特定波长光线激发时会发射出不同颜色的光。荧光显微镜的应用横跨多个科学领域，包括生物化学、生物物理学和医学，使得能够实时观察各种细胞培养。下面将探讨了荧光显微镜在生命科学应用中的重要性，并概述了其一般工作原理。
荧光显微镜-光学显微镜的一个子集
荧光显微镜技术在光学显微镜领域中独树一帜，是一个引人入胜的子集，为探究细胞结构的复杂世界提供了无与伦比的视角。该技术利用荧光现象，使科学家和研究人员能够以非凡的精确度深入微观宇宙。与传统的光镜不同，荧光显微镜采用荧光染料，在受到特定波长激发后能够发出光线。这不仅增强了对比度和可见性，还使得活细胞内动态过程的可视化成为可能。在通过高分辨率图像探索细胞观察的过程中，荧光显微镜作为一种强大的工具脱颖而出，揭示了细胞功能和行为的奥秘，其细节程度前所未见。
光学精准度，提升效果
推进荧光显微镜的光学精度涉及对多个因素的细致考虑。光路的优化至关重要，以确保激发光以最高效率到达样品。此外，选择并集成精确匹配的滤光片变得极为重要，仅允许所需波长对荧光信号做出贡献，从而提高信噪比。高品质涂层的应用进一步优化了光学元件，最大程度地减少了可能影响图像清晰度的反射和像差。在这种复杂的光学元件相互作用中，每个部件都协同地提升了显微镜系统的整体精度，从而实现了增强的分辨率，并促进了在纳米尺度上的精密测量。
荧光显微镜的组成部分
荧光在荧光显微镜下的成像得益于特殊的滤光片，这些滤光片允许特定波长的通过。荧光显微镜中的特殊滤光片包括。
-激发滤光片（Excitation filters）
-发射滤光片（Emission filters）
-二向分色分光镜（Dichroic beam splitter）
单独激发滤光片允许特定波长的光通过，这是为了激发待检测样本中特定染料所必需的。二向分色分光镜将激发波长反射到物镜上，物镜将光東聚焦到样品上。从样品上反射的光线被聚焦在物镜中，并且当处于激发状态时，该光线通常具有比入射光更长的波长。经过二向分色分光镜后，这部分反射光会穿过发射滤光片，其波长被调整到与发射相匹配的程度。尚未在二向分色分光镜处停止的刺激光残余会在发射滤光片处被过滤掉。理想情况下，只有发射光会击中显微镜中内置的探测器，并以相应的颜色变得可见。
图1荧光显微镜的工作原理
最佳的测量结果需要均匀的照明，特别是当需要几微米或毫米的大视场时。在照明不均匀的情况下，例如，可能引起待检测分子的不均匀活化。结果是中心分子的荧光比入射光束外围的分子更强烈（见图2）。如果边缘部分照明和中心不相等，那么在之后单独记录的图像网格合并时，阴影仍然会出现。因此，细胞和组织样本等测量结果无法用于可靠的分析。
图2左侧为使用高斯光束轮廓照明的测量样本，与右侧采用平顶（Top-Hat）光束轮廓照明的对比
Asphericon平顶光光束整形器提供了均匀的照明，从而实现了分子的均匀激活，以及几乎没有图像重叠的无边界拼接成像。
这类问题可以通过使用Asphericon光束整形器a|TopShape来克服。这个紧凑型系统利用非球面透镜进行光束整形，其应用能够将高斯光束转换为均匀的Flat-Top分布，从而在整个视野范围内实现均匀照明。产生的平坦场照明以其高空间相干性、无与伦比的光学性能和高度均匀性令人信服。
荧光显微镜参考
如前一节所述，基于激光的荧光显微镜中的定量分析可能会因高斯光束轮廓产生的非均匀照明而变得复杂。光源和照明光学元件等因素会影响均匀性。当需要检查较大的视野（FOV）时，这些特征尤为具有挑战性。在荧光显微镜中，通过图像网格生成测量图像。个体图像的获取方式使得边缘相互重叠，以便在后期处理中将它们拼接起来。如果照明不均匀，最终图像的每个个体图像周围都会出现变暗的边缘——细胞和组织样本的测量结果将变得不可靠。照明不均匀的另一个缺点是分子激活不均匀。靠近光束中心的分子比边缘处的分子荧光更强（见图2）。
图3 (a) 光束整形器示意图。(b) 实验装置设置。通过在TopShape后面使用扩束器，平场照明FFI被扩大了1.5倍，以便为样本提供全视野照明。
位于奥兰多的中佛罗里达大学光学与光子学学院（CREOL）的一个研究团队，通过将显微镜光束整形a|TopShape和a|BeamExpander扩束器集成到荧光显微镜装置中（见图3），成功克服了这些问题。这种平面场照明（FFI）装置能够将高斯光束塑形为均匀的Flat-Top分布。a|TopShape对入射激光束尺寸的变化具有极高的容忍度（±10%），并且能实现无色差操作。极佳的光学性能（均匀性>95%）使得照明均匀，从而激活分子。此外，FFI装置能够实现无边缝拼接成像，图像重叠最小（5%）。
总结：为了方便提供全视场照明，可以将Asphericon光束整形器a|TopShape和a|BeamExpander扩束器集成到荧光显微镜装置中，可以实现全视场的均匀照明。显微镜光束整形也就是显微镜匀化器可以实现显微镜均匀照明，扩束器可以扩大显微镜平场照明面积，也就是平场照明FFI扩大。
