作者： 时间：2021-11-13
普通的显微镜包含传统宽场荧光显微镜、共聚焦显微镜、双光子显微镜等等。法国Leukos超连续谱激光器的超连续谱光源波长范围在可见光及近红外区域，覆盖范围广，可以用于双光子成像，在超连续谱显微成像检测方面有优势，还可以用于其他多种应用。
一、共聚焦显微镜：
通过物镜，传统宽场荧光显微镜可以对焦平面成像，但焦平面附近也有光线干扰，这意味着我们得到了部分不需要的图像，使成像分辨率效果降低；且获得了额外的光毒性，影响到样品生物活性，甚至可能造成细胞死亡；
与传统宽场显微镜相比，共聚焦显微镜有许多有点：高清晰度、高分辨率、高灵敏度等等。因为在与样品焦面共轭的光学平面上，有一个小孔，因此接收器只收集焦平面上的信号，图像因此由模糊变为清晰，分辨率（尤其是Z轴方向）也有所提高。
由于共聚焦显微镜使用点扫描方式成像，为得到较快光的扫描速度，光束照射每个点的时间很短，成像元件（PMT）的量子效率低，因此需要更强的激发功率，这就造成了更强的光漂白和光毒性。
二、双光子显微镜：
由于多光子显微镜在深层组织成像方面的显着优势（长波长穿透性强，且在焦平面之外的光束无光学反应，更多的激发光到达焦平面），亚细胞分辨率和光漂白效应的影响有限（长波长的红外光细胞毒性小）。因此它逐步取代了通常的共聚焦显微镜系统，且双光子显微镜比单光子显微镜更适合用来观察厚标本、更适合用来观察活细胞、或用来进行定点光漂白实验。
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上面左图代表了超连续谱激光双光子的实验装置，基于奥林巴斯(BX61WI)的商业双光子显微镜，带有标准的基于电流计的扫描系统，二色镜，过滤器和光电倍增管(PMTs)。纳秒超连续谱激光器由一个脉冲泵浦激光器和1米长的实心PCE组成，泵浦激光器输出1ns脉冲，波长1550nm，重复频率为250kHz超连续光谱范围在500nm~2000nm。整个过程由计算机驱动，图像被重建。
上面右图代表了具有纤维结构的小鼠腿肌的样品。已知肌球蛋白组织具有二次谐波产生（SHG），通过免疫组化和AlexaFluor546的二抗标记，可确定了α-肌动蛋白（细胞骨架肌动蛋白结合蛋白）。图la和1d为α-肌动蛋白图像，图1b和le与肌球蛋白组织有关，图1c和1f表示全场和相对定位。
如上图，（a）代表激发光谱图像。在实验中，我们用氯胺酮/氧嗪麻醉的小鼠的大脑进行了活体成像，将稳定表达eGFP的胶质瘤细胞(GL261)被移植到小鼠的大脑中。肿瘤细胞被检测到，且TexasRed@共轭右旋糖酐(70kD)被注射到尾静脉，使皮层血管形象化，在（b）中，可以看到肿瘤细胞周围血管组织在几周内的演变。TexasRed@的双光子吸收光谱集中在840nm处，而eGFP的双光子吸收光谱集中在920nm处。
