基于SID4波前传感器的相位成像显微镜用于活体细胞的凋亡机制研究

帝国理工学院的Yolanda Ohene等人发表了一篇文章（Phase imaging microscopy for the diagnostics of plasma-cell interaction），关于使用相位成像显微技术研究活细胞与等离子体作用下的细胞凋亡机制，基于四波横向剪切干涉法（QWSLI）技术研发的PHASICS相位成像显微镜被用于观察细胞的生物学形态，在不同物质作用下，活细胞成像显示出不同的形态特点，对于细胞凋亡的研究有一定的重要意义。

采用四波横向剪切干涉法（QWLSI）获得生物样品的相位图像。QWLSI技术以高分辨率产生暴露于等离子体处理的细胞的相位图像，并能够定量分析细胞表面积随时间的变化。该方法显示了HTori正常甲状腺细胞的形态学变化。比较了对照细胞、经纳秒介质阻挡放电等离子体处理的细胞（包括经过氧化氢酶预处理的细胞）和经等量H₂O₂处理的细胞之间的细胞行为。等离子处理后仅5分钟就观察到细胞膜形态的主要变化。提出了活性氧物种（ROS）在这种降解中的主要作用。治疗后2-3小时观察到细胞核变形和凝聚，推测与细胞凋亡诱导有关。相位QWLSI与免疫荧光成像的耦合将更深入地了解等离子体诱导细胞死亡的机制。

等离子体在生物学和医学中的应用是一个广泛发展的新领域，探索非平衡等离子体与活细胞或组织的相互作用。与等离子作用相关的不同因素可能具有生物学相关性。它们是活性氧和氮物种（ROS和RNS）的产生；原子和自由基；电子激发态；电场；以及UV-A、UV-B和UV-C发射的产物。最近的研究证明了活性氧的主要作用特别是过氧化氢作为细胞死亡的介质。最近，有人提出电场和带电粒子可以改善明胶模型中ROS的吸收和扩散。评估每种等离子试剂的作用的困难主要是由于等离子形成的典型时间尺度与活细胞第一次可观察到反应之前的时间延迟之间的巨大差异。因此，该效应似乎受某些中间体的控制。本文的目的是测试一种高对比度相位成像显微镜，用于显示等离子处理下细胞中发生的早期形态变化。

生物样品的相位图像通过四波横向剪切干涉法（QWLSI）获得。该技术测量由细胞中折射率分布引起的光程差（OPD）。光程差是由于局部折射率的变化，沿单元厚度的相位延迟的累积。对于典型的乳腺细胞，整个细胞的最大相移为几百纳米量级。不同的细胞器通常引入几十纳米的OPD，而囊泡或纤维可以产生1nm或更低的OPD。在本研究中，通过使用波前传感器SID4Bio实现局部OPD测量，该传感器由改进的哈特曼掩模（MHM）和CCD摄像机组成，并添加到未改进的反向明场显微镜的横向端口。这样一个波前传感器测量的相位和光场复振幅相关。一般地，这个相位值与光程差的比值是波矢的大小，光程差（OPD）在通过样品的传播过程中累积，这是由于在折射率变化的物体中传播的光速变化。为了测量波前，入射光被衍射光栅分成四束波。这些衍射分束在CCD探测器上发生干涉，CCD探测器记录它们的干涉图。所获取的强度表现出变形的正弦图案。变形振幅与沿x和y的梯度成比例。为了修复图案变形，强度信号在1/p载波频率附近的傅立叶域中被去卷积。此外，直流傅里叶域用于重建强度图像。相位梯度最终被数值积分，导致光程差。在本文中，我们将展示这种处理产生的OPD图像。技术细节可在其他地方找到。

当至少一个电极被电介质覆盖时的放电配置称为介质棒放电（DBD）。DBD是广泛已知的并且用于产生活性物种，但它们只是最近才应用于生物样本的处理。对于塑料皮氏培养皿中的细胞处理，我们使用NanoSecondDBD（其他地方描述）等离子。简言之，商用脉冲发生器（FPG10，FIDGmbH）产生9kV（电极上的脉冲幅度加倍）和30ns持续时间的短高压（HV）脉冲，并通过25m长的同轴电缆传输至放电单元。一个高压脉冲在等离子体中沉积的总能量约为18mJ。等离子体在开放式扁平高压电极和塑料皮氏培养皿中的介质之间的2mm气隙中产生。接地电极置于皮氏培养皿下方。对于所有等离子体处理，施加频率为300Hz的10000个脉冲。配备PHASICS公司SID4BIO波前传感器的倒置亮场TE2000尼康显微镜用于获得参考细胞和等离子处理细胞的OPD图像。波前分析仪前端使用了两个尼康显微镜物镜：40×（NA=0.6）和100×（NA=1.3）浸油物镜，加上额外的1.5×管透镜，使总放大率达到150×。

培养人甲状腺上皮细胞系（HTori-3）在无酚红RPMI1640（Invitrogen，Inc.）中补充含1%（v/v）抗生素/抗真菌药（Invitrogen），2mmol/LL-谷氨酰胺（Invitrogen）和10%（v/v）FCS（PAA实验室）。在所有实验中，都是在处理前两天把15万个细胞种在35mm培养皿中培养。处理时，细胞达到60%-70%汇合。细胞用温的PBS（添加CaCl2和MgCl2）冲洗两次，并暴露于1.5mlPBS中的ns-DBD等离子体。在595nm处，在过氧化酶（HRP）存在下，细胞不可渗透的10-乙酰基-3,7-二羟基苯恶嗪（Amplifulu红试剂，SigmaAldrich）与H2O2反应产生的resorufin强度。对于H2O2处理，通过用CaCl2和MgCl2稀释PBS中的标准30%H2O2溶液（默克公司）获得相当于等离子产生的H2O2浓度100lM。对于过氧化氢酶（特异性酶H2O2清除剂）（默克）的实验，在处理前15分钟加入400U/ml。将细胞在等离子处理的PBS或过氧化氢溶液中孵育5分钟至1小时，然后用温PBS洗涤细胞两次，并提供新鲜的RPMI10%SVF培养基。在处理后1小时内，直接在皮氏培养皿中在活细胞上或在显微镜玻片和盖玻片之间用4%多聚甲醛（EMS）固定的细胞上拍摄相衬图像。在最后一种情况下，样品经过预先处理，可以保持在4◦C超过几天。

首先，对处理1小时后的活细胞进行显微镜分析。图形1（a）与处理细胞相比，对照细胞通常具有更大、更延伸的外观。细胞膜相对平滑，不同细胞的形状和大小有所不同。用H2O2处理的细胞（图1（b）)，使细胞膜轻微变形；可以看到细胞大小的轻微减小。等离子处理后，观察到显著的细胞收缩和细胞膜上突起的形成（图1（c）).在这种情况下，细胞大小明显小于对照或H2O2处理样品。

图中给出了更长时间尺度下150倍放大的图像2他们给出了每种条件下代表性细胞的两个示例。1小时后控制条件的图像突出显示了一些关键点

图1。在每种处理条件下，放大率为60和NA0.6的Htori甲状腺细胞的相位图像示例，带有用于细节增强的数字高通滤波器。在每个帧附近指示光学厚度的刻度（以nm为单位）。培养皿中的可视化。参考时间为治疗后1小时

图2。使用数值高通滤波器进行相位图像，用于在处理后的不同时间以150倍放大率（NA1.3）对细胞的每个条件进行细节增强。

甲状腺细胞的特征。核仁可见暗圈区。细胞膜清晰，与细胞溶胶相比具有稍大的光学厚度。膜的某些区域比其他区域更容易观察，通常这些区域是膜折叠到自身上的区域。H2O2处理的细胞在外观上与对照细胞相似，仅观察到微小变化。纳秒DBD等离子体治疗导致严重细胞的变化。显然，在等离子体处理后1h，细胞膜已变形，具有小的棘状突起。随着时间的推移，细胞质似乎从细胞中排出，留下应力丝的棘结构，如图所示2（c）等离子处理后膜突起和细胞收缩的形成可由显著的膜通透性引起。同时，细胞核受到强烈的变形和凝结，这是诱发脱垂的标志。

为了量化细胞形态的变化，分离出30个放大倍数为40倍的细胞，每种条件下的NA为0.6，并计算表面积（图3).测量结果表明，等离子体处理细胞的表面积与其他条件之间存在显著差异。尽管上述形态发生了变化，但对照细胞的表面积与H2O2处理的细胞相当。在所有实验条件下，经等离子体处理的细胞的表面积显著较低。

基于这些结果，人们特别有兴趣了解等离子处理细胞的变化何时变得可检测。图形4显示了分别在5、10和30分钟的时间段后用等离子体处理的细胞的相位图像。显然，在处理后5分钟，膜上的突起开始出现。在膜上形成的这些结构似乎是等离子体处理所特有的，并且在H2O2处理后没有观察到。

使用过氧化氢酶清除剂研究了等离子产生的过氧化氢在细胞死亡中的作用。等离子体处理前过氧化氢酶预处理的细胞图像如图所示5在处理后5分钟、1小时和2小时的时间段后对细胞成像。可以清楚地看到，在相同的时间段之后，细胞的外观与对照细胞非常相似。这意味着过氧化氢酶可以有效地保护细胞（图5)由等离子体作用引起的变化。另一方面，相当于等离子产生的过氧化氢浓度（图1（b）和2（b）)与等离子作用相比，细胞的形态变化明显减少。

图4。在等离子体处理后的指定时间段，使用数字高通滤波器在150倍放大率和NA1.3下对Htori细胞进行细节增强的相位图像。在每个帧附近指示光学厚度的刻度（以nm为单位）

过氧化氢酶保护细胞的事实意味着在上述条件下，尽管nsDBD中存在高电场，但与ROS作用相比，电场和紫外线的直接作用较小。如上所示，等离子体处理后，细胞膜迅速发生强烈变形。这可能是由于细胞膜完整性的部分丧失。应注意，在等离子体处理期间未观察到pH变化。尽管过氧化氢被证明是等离子产生的主要活性氧之一，鉴于其相对较低的反应性，应考虑能够与细胞膜反应的其他物种，如OH、O2-、HOO和OONO-18。最近，使用EPR自旋阱测量了等离子体射流处理的PBS中的超氧阴离子、羟基和过氧化氢自由基浓度。羟基自由基可直接与膜分子相互作用，导致共价C-O、C-C和C-N键断裂；然而，其在介质中的低寿命（1ps）几乎阻止OH扩散。过氧亚硝酸盐自由基可在超氧阴离子与一氧化氮反应中产生，并且能够通过脂质过氧化机制渗透细胞膜。此外，OONO-可由过氧化氢酶的血红素基团产生，尽管其寿命尚未确定。氢过氧化物也能有效地引发脂质过氧化，而O2-由于其电荷和快速歧化，似乎不会直接与细胞膜相互作用。需要对等离子体产生的反应性物种进行进一步的实验研究，这些反应性物种可以与细胞膜相互作用，诱导细胞死亡。过氧亚硝酸盐和过氧化氢似乎是很好的候选者，将在未来的工作中进行研究。

相位成像技术的能力，已证明四波横向剪切干涉法可诊断等离子体对活细胞的作用。QWLSI能够产生细胞的相位图像，并能够定量分析细胞表面积随时间的变化。QWLSI技术在轴向上记录的最小光程差低于1纳米。由于OPD图像的高对比度，细胞膜清晰可见，并且容易检测到由于细胞修饰引起的变形。在处理后5分钟-6小时的时间尺度上显示了HTori正常甲状腺细胞的形态学变化。对照组细胞、H2O2处理的实验组和纳秒介质阻挡放电（DBS）等离子体处理之间的细胞行为比较表明，等离子体处理导致细胞膜在处理几分钟后开始明显受损。数小时后观察到细胞核变形。为了揭示细胞死亡的类型，免疫荧光将在未来的工作中与QWLSI相结合。提出了短生命物种在膜脂质过氧化中的作用，并将在未来的实验中进行更详细的研究。

参考文献

Yolanda Ohene, Ilya Marinov, Lucie de Laulanié, Corinne Dupuy, Benoit Wattelier, and Svetlana Starikovskaia. Phase imaging microscopy for the diagnostics of plasma-cell interaction. Applied Physics Letters 106, 233703 (2015); doi: 10.1063/1.4922525