显微镜均匀照明用于定量荧光成像，均匀照明图像拼接

宽场荧光成像是研究亚细胞过程分子机制的有力工具。它被广泛应用于筛选各种疾病的药物，以及通过基于图像的高通量系统对细胞表型进行分析。在这些应用中，荧光强度是分析图像的主要信息，其荧光信号取决于入射光，所以均匀的照明对于进行定量分析是至关重要的，包括光源和光学器件在内的很多因素。对于细胞表面附近的单分子或细胞器的成像，激光常被用作激发源，但其不均匀性的照明使强度数据失真而造成测量的不准确。显微镜均匀照明对于定量荧光成像、图像拼接本具有非常重要的作用，文给出了一种显微镜均匀照明/显微镜平场照明的方案。

产生均匀性照明的一种较为关注的方法是利用一对非球面透镜产生一个平场照明（flat-fieldillumination，FFI）轮廓（如图1（a））。但是，由于对表面质量的要求和有限的工作距离，这种折射式激光光束整形系统在荧光显微镜中的应用一直是挑战。要解决这些问题，使用专门设计的光束整形器Topshape和Airyshape，在一定的波长范围内对普通荧光显微镜优化而得到显微镜均匀光斑，简单而高效的平场照明是一种很有前瞻性的荧光定量成像方法。在Asphericon如图1（b）的方案中，从单模光纤射出的激光束（λ=638nm）被消色差透镜准直，通过将准直的高斯光束（直径约10mm）送到TopShape的光束整形器上产生FFI。如图1（c）和1（d）所示，FFI产生了一个显微镜平顶光斑，FFI的最大90%处的全宽（FW90M）为81.5 μm，这与视场(field-of-view, FOV)的直径（~82 μm）相似，而作为参考的80mm或150mm焦距的镜头准直的高斯光束的FW90M分别为15.0 μm或28.6μm。通过计算强度的均方根值来估计FFI的不均匀性仅为2.9%，该程度的不均匀性并不影响单分子成像和荧光纳米镜。80 mm和150 mm焦距镜头的高斯光束的照明效率为92.9%和51.4%，而FFI的照明效率为85%，这意味着大部分FFI被检测器收集。在561nm和638nm的激发波长下，不需要额外的光纤或准直器就可以实现多色成像（图1（e））。在这两个波长下，均匀的显微镜平顶光斑轮廓在工作距离上保持在300毫米（图1（f）和1（g））。

图1.FFI的实验特征 (a) 光束重塑原理图；(b) 实验装置：BE，1.5倍扩束器；F1-2，激发/发射滤光片；

DM，分色镜；FM，翻转镜；L1-3，透镜；M1-6，镜子；Obj，物镜；SMF1-2，单模光纤；TL，管透镜；

(c) 由焦距为80mm或150mm的透镜准直的高斯光束的光束轮廓，以及没有和有光圈的FFI光束；

(d) 沿着虚线从(c)中的光束剖面取线；(d)中的垂直虚线表示照相机的探测区域；(e) 激发波长对FFI的影响

显微镜均匀照明所得到的均匀荧光信号可以使得寻找斑点对阈值并不那么敏感。阈值参数用于确定一个斑点是否足够亮，以便从噪声水平中辨别出来。如图3(a)，在高斯光束下，随着阈值参数的增加，检测到的斑点数量稳步下降，而FFI表现出一个明显的高峰，其显微镜均匀光斑的数量对阈值参数不敏感，从而可以确定真正的斑点数量。图4（b），FFI的强度分布要较窄，有可识别的中心强度，其分布更适合于高斯分布曲线。也就是说FFI是可以改善基于强度的定量分析。

图3.用FFI进行定量单分子成像分析。(a) 阈值曲线显示检测到的分子的平均数量与背景阈值参数的关系

(b) 在高斯照明和FFI下成像的单一和双探针样品的强度分布

在FFI下，分子表现出更均匀的荧光（图4（a））。图4(b)中，不同X坐标的单分子的强度轨迹清楚地显示了这一特征。在多模光纤（multimode fiber, MMF）与斑点扰频器结合的照明下，5nM荧光标记下所拍摄的图像（黄色虚线）所示，对于全内反射荧光（total internalreflection fluorescence, TIRF）的情况，MMF只实现了部分TIRF，而FFI实现了全部TIRF。

图4.通过TIRF照明减少背景

在FFI下，实现了无边界的缝合成像。其均匀照明图像拼接的重叠度极低（5%），而使用高斯照明的缝合图像在成像区域之间有明显的暗边界，此外，使用低倍率（20倍）物镜与FFI相结合的可行性（图5（b））。图5(c)描述了显微镜均匀照明与高斯照明相比，FFI提高了高通量TIRF和细胞的外显率成像。这表明了显微镜均匀照明方案优化了均匀照明图像拼接的效果，并尽量减少高通量成像的光漂移。

图5.FFI下的无边界图像和高斯照明的缝合图像对比

所以，Asphericon所做的基于折射的光束整形系统对多色宽视场荧光显微镜均匀照明的方案中，进行平场照明是适用于TIRF照明的Topshape和Airyshape。FFI的长工作距离和高空间相干性能够完成均匀的外延和全内反射荧光（total internalreflection fluorescence, TIRF）照明，以用于多色单分子成像，如宽场荧光成像，它能有效地拒绝背景荧光而达到高通量成像的效果，且对进入的激光光束大小的变化有极大的容差度和无色差。FFI的同质照明曲线使基于强度信息的单分子定量分析成为可能。

材料和方法：

-平场照明荧光显微镜：奥林巴斯IX73倒置显微镜构建成像系统

-光束轮廓测量：用高斯或FFI光束激发染料层来测量强度曲线