螺旋相位板在受激发射损耗系统中的应用

受激发射损耗(stimulated emission depletion，STED)显微镜是常用于研究亚微米样品，尤其是在生物学方面。相比于传统光学显微镜在衍射极限导致的分辨率限制，受激发射损耗（STED）显微镜可实现显微镜的超分辨率，即分辨小于光学系统的衍射极限的细节，它在原理上是通过以STED环形光束（甜甜圈）的荧光光源照射来得到超分辨率图像，照射过程中，把STED环形光束（甜甜圈）外部区域的荧光耗尽，从而使样品焦点处的入射光区域最小化并提高特定系统的可实现分辨率。

典型的受激发射损耗（STED）显微镜系统包括两个独立的光学通道：一个是用于长波长（红色）损耗激光，另一个是用于短波长（绿色）激发激光。这两个光束通道通过分色镜组合在同一光路中，然后通过物镜聚焦到样品上，而样品中反射出来的荧光被送到检测器中。如图1所示性描述。激发激光由物镜聚焦，而损耗激光在被物镜聚焦之前通过螺旋相位板（spiral phase plate，SPP）传播，也就是螺旋相位片。螺旋相位板DOE在入射的高斯光束上增加了一个螺旋波前，从而在物镜的焦平面上将其转换为受激发射损耗环形光束（甜甜圈）。

图1 STED显微镜系统的设置示意图

受激发射损耗（STED）显微镜是一种测量亚微米结构的技术，它要求系统具有高度精确性和准确性，否则，整体性能可能会受到严重影响。对于受激发射损耗环形光束的应用，设计和建立受激发射损耗（STED）显微镜系统是一项复杂的任务，需要在激光设计、激光光学、一般几何和物理光学概念、激光光束成型、机械学、电子学、分析软件等领域的多学科知识。Holoor提供大量的标准和定制衍射光学元件和微型光学元件产品，包括多通道分光器、空间光束整形器（平顶、均质器/扩散器、环形/甜甜圈整形器）、焦点光束整形器（多焦点、拉长焦点）。其中，衍射光学元件DOE被集成在各种应用领域的激光系统中，精确性是便是衍射光学技术的优势所在。在受激发射损耗（STED）显微镜系统中，螺旋相位片通过改变光束传播的相位，主要是多通道分割、空间整形和焦点整形，以满足各种整形功能，从而实现STED环形光束。为了达到最佳的涡旋光学效率，螺旋相位板通常采用多达4个光刻步骤来创造16个层次的微结构。图2显示了一个由光学轮廓仪测量的16级螺旋相位板的实际衍射结构。通常来说，由熔融石英制成的衍射透镜DOE具有较好的的激光损伤阈值，表面偏差和微粗糙度，以及机械性能。

图2 使用光学轮廓仪测量的16级螺旋相位板衍射表面。

Holoor使用Zemax OpticStudio®设计软件对简化的STED显微镜进行建模的方法，在螺旋相位板在受激发射损耗（STED）显微镜系统的应用上，其主要是在两个不同波长的单模高斯激光器中放分别的光路中，两个激光光源都由同一个消色差物镜聚焦，损耗激光被螺旋相片板转换成成环形能量环。在图3a中的几何图像分析（Geometrical Image Analysis，GIA）中显示了受激发射损耗环形光束的空间强度分布；图3b显示了高斯分布激发激光器的空间强度分布；图3c显示了损耗激光和激发激光在超分辨率下的效果；图3d显示了受激发射损耗环形光束和高斯光束的强度曲线。

当使用相同的Zemax模型进行焦点深度（DOF）分析在进行焦点深度（DOF）分析时，通过将图像表面旋转90°就可以对焦深（depth of focus，DOF）进行分析。这样便可以容易地呈现X-Z或Y-Z图像平面，而不是呈现标准的X-Y图像平面，可以了解到Z轴上的光强进行分析，对于分析光束束腰位置和图像的散焦范围是比较有优势的。如图4显示了受激发射损耗（STED）显微镜系统实现STED环形光束效果，使用螺旋相位片后每个独立激光通道的焦深（DOF）性能以及它们在X-Z平面上的组合性能。

图5 STED显微镜系统的DOF模拟：a，耗尽通道；b，激发通道；c，组合视图。