作者： 时间：2023-08-18
荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization, FISH）是指利用荧光染料做标记，已知序列的单链核酸作为探针，通过碱基互补配对原则，与待检样品中核酸进行特异性结合，然后通过观察荧光信号，从而对样品中待检核酸进行定性，定量及定位分析。FISH具有快速，信号强，特异性高以及可以多重染色等特点，广泛应用与产前诊断，基因组结构分析等领域。
影响FISH结果的因素有很多，其中包括样品准备和处理，显微镜，光源，荧光探针以及滤光片。FISH通常基于荧光显微镜来观测信号，利用滤光片包括激发片，二向色镜和发散片三种。其工作原理如下图所示：
-激发片：选择透过光源某部分波段的光，用来激发荧光探针；
-二向色镜：反射光源的光至样品，透过产生的荧光并反射激发光的散射光；
-发散片：选择透过荧光的某部分波段的光至检测器或人眼，并完全阻挡掉激发光的杂散光。
在FISH实验中，滤光片带宽的大小会对FISH图像的对比度产生重要的影响。增加带宽会提高激发和接收效率，使接收的信号增强。但实际接收的信号中同时包含了探针的荧光信号和样品的背底噪音，带宽的增加会同时增加这两者的强度。带宽减小，虽然可以降低背底噪音的强度，但荧光信号也会随之减弱。所以对于对比度要求很高的FISH实验，针对于每种具体的染料，都会存在一个最佳的带宽，使FISH图像能够达到最佳的对比度。Chroma滤光片在荧光原位杂交中的应用源自于Chroma FISH滤光片的带宽都是根据常用的FISH染料做过优化可以为用户的FISH实验提供最佳的图像对比度。
如图所示：B的信号比A多91%，但是B的噪音比A多226%。A具有更好的对比度！
Chroma FISH滤光片组具有以下特点：
-高透过率、高截止深度和高光谱陡度；
-保证足够亮度的同时，提供最佳的图像对比度；
-消除串色的影响；
a. 消除Gold和Aqua串色到Green通道；
b. 消除Gold和Orange串色到Red通道；
-对多波段滤光片组中的DAPI通道进行特殊处理，避免DAPI信号过强而将其他通道信号掩盖；
-多色图像叠加零漂移；
-磁控溅射镀膜，终身质保。
ET系列—FISH单波段带通滤光片组
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滤光片组 |
激发片CWL/FWHM |
二向色镜50% cut-on |
发散片CWL/FWHM |
FISH探针 |
备注 |
|
49000 |
350/50 |
400 |
460/50 |
DAPI |
|
|
49028 |
395/25 |
425 |
460/50 |
DAPI |
用于395nm光源 |
|
49301 |
405/10 |
425 |
460/36 |
Blue |
|
|
49302 |
436/20 |
455 |
480/30 |
Aqua |
|
|
49303 |
495/25 |
515 |
537/29 |
Green |
用于有Aqua，无Gold时 |
|
49308 |
485/25 |
505 |
525/30 |
Green |
用于无Aqua，有Gold时 |
|
49312 |
490/20 |
505 |
525/20 |
Green |
用于有Aqua，有Gold时 |
|
49304 |
546/10 |
556 |
572/23 |
Gold |
|
|
49305 |
546/22 |
565 |
590/30 |
Orange |
用于无Red时 |
|
49309 |
539/21 |
556 |
576/31 |
Orange |
用于有Red时 |
|
49306 |
580/20 |
600 |
625/30 |
Red |
用于无Gold，无Orange时 |
|
49310 |
592/21 |
610 |
630/30 |
Red |
用于有Gold，无Orange时 |
|
49311 |
599/13 |
612 |
632/28 |
Red |
用于有Orange时 |
|
49307 |
630/20 |
647 |
667/30 |
Far Red |
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|
49009 |
630/30 |
660 |
690/50 |
Far Red |
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ET系列—FISH多波段滤光片组：
DAPI是一种能够与DNA双链特异性结合的有机荧光染料。在FISH实验中，DAPI主要用来对整个细胞核进行染色成像，这就导致了DAPI的浓度要远高于其他FISH探针的浓度。而在有些FISH实验流程中，DAPI是在最后一步进行染色，染色之后也没有清洗的步骤。
在使用多波段滤光片进行多色FISH实验中，为了避免DAPI的信号将其他FISH探针的信号掩盖，在Chroma的多波段滤光片组中，会刻意降低激发片在DAPI处的透过率，从保证DAPI的信号不至于过高。
DAPI和Aqua的发射峰高度重叠，通常情况下同时做两种探针的成像会很困难，因为大量的DAPI信号会将Aqua 信号掩盖掉。
Chroma滤光片在荧光原位杂交中的应用：
Chroma的69014滤光片组，通过降低DAPI的激发效率。能够实现DAPI，Aqua，Green和Orange四色的同时观察。DAPl和Aqua采用不同的激发波段，但共享同一个接收通道。
